你必须得到相同的对象删除，而不是一个副本。

Users us_end;

foreach (var VARIABLE in ((List<Users>)Application["Users_On"]))
{
    if(VARIABLE.Id == (int)Session["Current_Id"])
    {
       us_end = (Users)VARIABLE;
       break;
    }
}

if (us_end != null)
{
    List<Users> us = ((List<Users>)Application["Users_On"]);
    us.Remove(us_end);
    Application["Users_On"] = us;
}

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编辑：

只是为了在这里澄清一个地址，正如pst指出的那样，你也可以实现IEquatable接口和一些覆盖，比如Groo的答案，以使其工作，但我认为这是在这个特定的主题上矫枉过正。把这作为最常见的实践，但要明确的是，它也可以从列表中删除项目，即使它们是不同的示例，甚至是不同的对象。
参考号：http://msdn.microsoft.com/en-us/library/ms131187.aspx

默认情况下，在.NET中通过引用比较对象相等性（除非Equals被重写，否则每个对象都继承自object.Equals）。如果您希望Remove方法找到您的对象，则不能传递新对象。
最简单的方法是找到具有所需属性的实际对象，然后删除它：

var id = (int)Session["Current_Id"];
var list = (List<Users>)Application["Users_On"];  

// find the exact item to remove.
var itemToRemove = list.FirstOrDefault(u => u.Id == id);

// if found, remove it
if (itemToRemove != null)
{
    list.Remove(itemToRemove);
}

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您正在创建一个 newUsers对象-这与Application["Users_On"]中已有的任何对象都不相同（它将具有不同的引用），因此它不会被删除。
这假设Users中没有覆盖/实现Equals和/或IEquatable<T>。

List<Users> us = ((List<Users>)Application["Users_On"]);
Users us_end = us.Where(u => u.Id == (int)Session["Current_Id"]).FirstOrDefault();
us.Remove(us_end);
Application["Users_On"] = us;

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顺便说一下-你的变量命名不是很好-去更多的描述性名称。

关于：

List<Users> us = ((List<Users>)Application["Users_On"]);
Users us_end = us.First(x => x.ID == (int)Session["Current_Id"]);
us.Remove(us_end);
Application["Users_On"] = us;

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通过在remove语句中找到项目来删除它，而不是通过额外的副本：

List<Users> us = ((List<Users>)Application["Users_On"]);
us.Remove(us.FirstOrDefault(u => u.ID == (int)Session["Current_Id"]));
Application["Users_On"] = us;

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正如有人在前面的回答中所说：在. NET中，对象相等性是通过引用进行比较的。但是你可以从类和结构之间的差异中受益，只需将List中的元素T从类转换为结构。